| opticsky |
2007-07-18 11:40 |
激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及其應(yīng)用
樣品要求： =Gg)GSL^
1.經(jīng)熒光探劑標(biāo)記(單標(biāo)、雙標(biāo)、三標(biāo)） HTtGpTsF
2.固定的或活的組織 >. nt'BQ
3.固定的或活的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞(Confocal專用小培養(yǎng)皿，蓋玻片) yM#trqv5
4.懸浮細(xì)胞，甩片或滴片后，用蓋玻片封 3
Q%k (,
一. 組成 HV .|Eh_7
倒置或直立熒光顯微鏡、掃描頭(照明針孔、探測(cè)針孔、熒光濾片系統(tǒng)、鏡掃描系統(tǒng)和光電倍增管)、掃描頭控制電路、計(jì)算機(jī)和圖像輸出設(shè)備 w2C!>fJ]1
二. 原理 JjTzq2'%
Confocal !y2h`ZAZ
利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。 Gp3t?7S{T
三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn): a ~iEps
1.點(diǎn)照明 ht74h
2.具有照明pinhole和探測(cè)pinhole *d,n2a#n5
3.照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛(共焦), 共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面 U %PMV?L{
4.具有掃描系統(tǒng)―― 逐點(diǎn)掃描成像 8w x#,Xa
5.具有多個(gè)（四個(gè)） 熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物 OD@A+"
Leica TCS NT 的技術(shù)指標(biāo): 'JKvy(n>
1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x &#b>AAx$2Y
傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61l/NA ~\s &]L
Confocal: Rxy=0.4l/NA .=w`T
#L
2. 樣品的最大厚度:大約 2mm(10X/0.2物鏡) o-i.'L)X
取決于三點(diǎn): wb
Tg
物鏡的景深, 與NA成反比 t T/*ZzMq#
Z軸的最大移動(dòng)范圍 sbiDnRf
激光的穿透力 "YvBb:Z>
3. 樣品的最小光切厚度: 大約0.35 mm =
| |