大視場(chǎng)、高分辨率介觀顯微鏡物鏡

光學(xué)顯微鏡是生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域不可或缺的研究工具。物鏡是顯微鏡的核心部件，決定了顯微成像的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：分辨率和成像視場(chǎng)（FOV）。

這兩個(gè)參數(shù)相互制約。數(shù)值孔徑（NA）為 0.5 的商用顯微鏡物鏡具有亞微米分辨率，但其成像視場(chǎng)通常僅限于 1 毫米左右。2014 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了超分辨率顯微鏡技術(shù)，該技術(shù)大大提高了成像分辨率。

然而，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高分辨率和大視野仍然是一項(xiàng)研究挑戰(zhàn)。近年來(lái)，對(duì)跨尺度高通量成像的需求與日俱增，但傳統(tǒng)顯微鏡物鏡無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)和高分辨率。

這就給大型樣品的高分辨率成像帶來(lái)了困難。通常的方法是以較小的視場(chǎng)角對(duì)樣品進(jìn)行多次成像，然后將圖像拼接在一起，形成所需的成像區(qū)域。然而，這種方法會(huì)在拼接邊緣產(chǎn)生偽影，而且成像速度較慢，無(wú)法實(shí)時(shí)觀察樣品的動(dòng)態(tài)變化。

為了解決這些問(wèn)題，人們提出了介觀物鏡。它們具有復(fù)雜的光學(xué)結(jié)構(gòu)和出色的像差優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)高 NA 和超大成像 FOV，顯著提高光學(xué)顯微鏡的成像通量。

2016 年，斯特拉思克萊德大學(xué)首次研制出 NA 值為 0.47、FOV 為 6 毫米、工作波長(zhǎng)范圍為 400 納米至 700 納米的介觀物鏡。同年，《物理世界》雜志將其評(píng)選為年度十大物理學(xué)突破之一。隨后，國(guó)際上也有相關(guān)研究的報(bào)道。

然而，在大視野范圍內(nèi)優(yōu)化色差極具挑戰(zhàn)性。目前的介觀物鏡僅限于可見(jiàn)光或近紅外等單一成像波段，無(wú)法滿足單光子或雙光子等多種熒光成像的要求。此外，現(xiàn)有介觀物鏡的視場(chǎng)角集中在 3 毫米到 6 毫米之間。越來(lái)越多的應(yīng)用場(chǎng)景要求進(jìn)一步提高成像視野，以實(shí)現(xiàn)更高的成像吞吐量。

為了克服目前介觀物鏡成像波段窄、成像視場(chǎng)不夠大的障礙，中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所史國(guó)華研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究小組設(shè)計(jì)了一種用于介觀領(lǐng)域的平場(chǎng)全消色差物鏡結(jié)構(gòu)，研制出了世界上成像視場(chǎng)最大、工作波長(zhǎng)最寬的亞微米分辨率介觀物鏡。

該物鏡具有 8 毫米直徑的 FOV，0.5 NA，成像波長(zhǎng)范圍為 400-1000 納米，具有在可見(jiàn)光和近紅外波段成像的獨(dú)特能力。這項(xiàng)工作在《光電進(jìn)展》（Opto-Electronic Advances）上進(jìn)行了報(bào)道。

圖片:wide-field-high-resolu.jpg

（a）介觀物鏡的結(jié)構(gòu)，（b）介觀物鏡的像差分布，（c）用介觀物鏡構(gòu)建的寬視場(chǎng)成像系統(tǒng)，（d）用介觀物鏡構(gòu)建的激光點(diǎn)掃描成像系統(tǒng)。

物鏡由10組共19片透鏡組成，采用三組像差優(yōu)化設(shè)計(jì)。

前組包括一個(gè)雙倍透鏡和一個(gè)三倍透鏡，采用近似平面設(shè)計(jì)，既能達(dá)到所需的 NA 值，又能最大限度地減少像差。中間組包括一個(gè)單透鏡、一個(gè)雙倍透鏡、一個(gè)三倍透鏡和兩個(gè)雙高斯配置的雙倍半月板透鏡，主要校正前組的像差。后組包括兩個(gè)單透鏡和一個(gè)雙透鏡，用于校正殘余像差。

為了優(yōu)化色差，前組使用低色散玻璃來(lái)減少色差。中間組的對(duì)稱(chēng)半月形透鏡結(jié)構(gòu)可補(bǔ)償橫向色差，三重透鏡可補(bǔ)償軸向色差。

后組采用折射率相似但色散明顯不同的雙透鏡結(jié)構(gòu)，并采用大氣隙補(bǔ)償色差。組合結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)滿足了像差優(yōu)化要求，最終實(shí)現(xiàn)了從可見(jiàn)光到近紅外波長(zhǎng)的中視場(chǎng)全色校正。

為了驗(yàn)證物鏡的成像性能，研究小組進(jìn)行了各種性能測(cè)試。使用該物鏡對(duì)分辨率測(cè)試圖進(jìn)行成像時(shí)，測(cè)得明場(chǎng)分辨率為 714 lp/mm，熒光微球分辨率為 0.74 μm，場(chǎng)失真為 0.46%。

在對(duì)小鼠大腦和腎臟切片進(jìn)行成像時(shí)，獲得了每幀 13.5 億像素的圖像。與 20 x 0.5 NA 的商用物鏡進(jìn)行的定量比較顯示，中視物鏡的成像質(zhì)量與商用物鏡相似，但成像場(chǎng)面積是商用物鏡的 40 多倍。

圖片:wide-field-high-resolu-1.jpg

（a-c）小鼠腦成像結(jié)果，（d-g）小鼠腎臟熒光成像結(jié)果。

為了驗(yàn)證該物鏡的掃描成像能力，研究小組建立了一個(gè)激光點(diǎn)掃描介觀成像系統(tǒng)，在 488 納米連續(xù)光激發(fā)下獲得了單光子熒光成像結(jié)果，在 920 納米飛秒脈沖光激發(fā)下獲得了雙光子熒光成像結(jié)果。

單光子成像的信號(hào)強(qiáng)度更高，而雙光子成像的成像對(duì)比度更高。這也是首次利用介觀物鏡同時(shí)實(shí)現(xiàn)單光子和雙光子成像。

這種物鏡在大規(guī)模樣本的高分辨率成像方面具有巨大潛力，例如腦圖譜、跨腦區(qū)單光子和雙光子成像以及有機(jī)體的高分辨率成像。

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論文鏈接：https://dx.doi.org/10.29026/oea.2024.230212