激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，簡(jiǎn)稱LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化。已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域，對(duì)生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。 j; )-K 3Ia
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創(chuàng)建于1983年的美國(guó)Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項(xiàng)具有劃時(shí)代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國(guó)“政府新產(chǎn)品獎(jiǎng)”和兩次“高科技領(lǐng)先技術(shù)獎(jiǎng)”，它能達(dá)到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實(shí)時(shí)，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器。現(xiàn)以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。 /tGj`C&qtw
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1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成 Z3]ut #`
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有關(guān)共聚焦顯微鏡的某些技術(shù)原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡，1985年WijnaendtsVanResandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。 00 )=3@D
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激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)擴(kuò)束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長(zhǎng)通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個(gè)方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過(guò)物鏡、長(zhǎng)通分色反射鏡、聚焦透鏡、會(huì)聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，再通過(guò)焦點(diǎn)處的針孔，由檢測(cè)器接收。 yzQ^KqLH
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只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才夠到達(dá)檢測(cè)器，其它位置發(fā)出的光均不能過(guò)針孔。由于物鏡和會(huì)聚透鏡的焦點(diǎn)在同一光軸上，因而稱這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過(guò)程中針孔起著關(guān)鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學(xué)顯微鏡掃描方式成像，而且對(duì)圖像的對(duì)比度和分辨率有重要的影響。 j I9Kn41
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ACASULTIMa312采用快速鏡掃描或臺(tái)階掃描對(duì)樣品逐點(diǎn)掃描成像，由于樣品中不同的掃描點(diǎn)始終在物鏡和會(huì)聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個(gè)樣品，掃描精度達(dá)0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當(dāng)激光逐點(diǎn)掃描樣品時(shí)，針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對(duì)應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，并將之轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚聚焦圖像。一個(gè)微動(dòng)步進(jìn)馬達(dá)控制栽物臺(tái)的升降，使焦平面依次位于標(biāo)本的不同層面上，可以逐層獲得標(biāo)本相應(yīng)的光學(xué)橫斷面的圖像。這稱為“光學(xué)切片”。再利用計(jì)算機(jī)的圖像處理及三維重建軟件�？梢缘玫礁咔逦葋�(lái)表現(xiàn)標(biāo)本的外形剖面，十分靈活、直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。
